二手液相色谱 法之 手性色谱法
不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。例如抗高血压药物a -甲基多巴是S-(-)体;又如氯霉素(含有二个手性碳原子)，只有D-(-)异构体有效。而L-(+)异构体完全无效。沙利度胺(反应停)的两个对映体对小鼠镇静作用的效价相近，但只有左旋异构体才有胚胎毒及致畸作用。因此，对映体的分离，在药物的制备和质量控制方面，都具有重要的意义。对映体在普通条件下的理化性质是相同的，因此分离对映体需要在手性条件下进行。分离对映体的色谱方法称为手性色谱法。二手液相色谱法之手性色谱法分为间接法和直接法两种。间接法是将对映体与一定的手性衍生化试剂反应，使其由对映体转变为非对映体，再利用他们理化性质的差异，用-般的色谱条件进行分离。直接法不需作衍生化反应，直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离，应用较多，以下主要介绍二手液相色谱法之手性色谱法的直接法。

1手性固定相
手性药物拆分前的对映体通常以镜象存在，即以外消旋体形式存在。用常规分析和制备方法不能将其拆分，需引入不对称( 即手性)环境，使欲拆分的对映体(样品)、 手性作用物(比如固定相)和手性源形成一个非对映异构分子的络合物。为了形成这样一种分子络合物，分子之间要有-种同时相互存在的作用力，以保持分子的空间定位。Dalgliesh 认为至少要有三个作用力，其中一个要有立体选择性，可以是吸引的，也可以是排斥的。这就是“三点相互作用”理论。如果对映体中某一种对映体正好与此三个作用点配对，相互作用较强，保留时间就长。而另一种对映体因空间构成不同，不能完全配对，作用相对较弱，保留时间就短，从而可以得到分离。固定相的作用可以是氢键、偶极一偶极作用、π_π作用、静电作用、疏水作用或空间作用等。
常用的手性固定相有以下几种：
(1)Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美国学者Pirkle主持研制的，主要有π -碱性(斥电子基)手性固定相和π酸性(吸电子基)手性固定相。在分离的过程中，化合物与固定相之间发生π-π电荷转移相互作用，此类固定相为电荷转移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把(R)-N3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸( dinitrobenzy1 phenylglycin) 键合到氨丙基硅胶上。
(2)蛋白质类手性因定相
蛋白质是由手性亚基团氨基酸组成的大分子物质，蛋白质类手性固定相是将蛋白质通过氨基酸键合到硅胶上而制成的。常用的蛋白质类手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP) 的手性固定相，商品有Chiral AGP, Resolvosil, Enantio Pac等 。蛋白质类手性固定相应用范围较广，效果良好，但该类固定相的谱柱容里较小。常用洗脱系统是磷酸盐缓冲溶液(PH4~7)， 离子强度为0~ 500mmol,有机改性剂不得超过5%。用蛋白质类手性固定相拆分酸性和碱性倾倒物对映体时，流动相内可分别加少童离子对试剂，如.N,N-二甲基辛胺，叔丁胺氢溴酸盐和辛酸，以获得理想的分离结果。
(3)多糖类手性固定相
多糖类手性固定相中应用最多的是环糊精。环糊精(cyclodextrin, CD)是一类环形寡聚糖，为手性高分子物质，根据分子中葡萄糖单元的个数不同，环糊精可分为a、β、γ三类，他们分别由6、7、8个D_吡喃葡萄糖组成，将CD分别通过硅烷链连接在硅胶表面就构成环糊精手性固定相。环糊精分子成锥桶状，内腔的直径由组成环糊精的葡萄糖个数决定，如常用的_环糊精由7个葡萄糖分子组成，内腔直径为0.8nm。用环糊精手性固定相进行分离时，首先要求被拆分的组分进人洞穴，形成包合物，保留时间以组分能否进人洞穴及其紧密的程度而定，环糊精环上还有多个手性中心，能选择性地与对映体作用，从而导致对映异构体的保留不同而被分离。如用β-环糊精手性固定相已经成功地分离了二茂铁等金属有机络合物、氨基酸以及生物碱等。除环糊精外，多糖类的手性固定相还可以用纤维素、直链淀粉作成，如纤维素三醋酸醋手性固定相、纤维素三苯甲酸醋手性固定相和纤维素氨基甲酸酯手性固定相等。
(4)冠醚(Grown ether) 类手性固定相.
冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚键的环状化合物，呈王冠状结构，外层是亲脂性的乙撑基，环的内层是富电子的杂原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙炜骨架或硅胶上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分离对映体时，不同对映异构体因与冠醚环腔形成的主客体络合物的稳定性不同而被分离。在冠醚上引人双萘基，双萘基可以形成“手性墙”增加固定相的立体选择性。能质子化的氨基化合物，特别是氨基酸对映体在冠醚手性固定相上可以得到很好的分离。

  2.手性流动相拆分法
手性流动相拆分法是将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与对映异构体结合的稳定常数不同或结合物在固定相上分配的差异进行分离。近年来，手性流动相拆分法已广泛应用于药物对映体的拆分。此法的最大优势在于:可采用普通的非手性固定相，不需对样品.进行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更换，同时添加物的可变范围较宽，稳定性好，且价格便宜。
(1)配体交换型手性添加剂
配体交换型手性添加剂由手性配基和含二价金属离子的盐组成o手性配基多为具有光学活性的氨基酸及其衍生物，他们和二价金属离子螯合，分布于流动相中，遇到待分离的对映异构体时，即形成配合物，再在流动相和固定相之间分配而实现分离。分离的机理-般认为.是配基和金属离子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成动态的手性固定相而发挥作用。也可以看成是手性配基、金属离子和对映异构体形成的配合物稳定常数不同而产生分离o采用5µm粒径的C18固定相，阿司帕坦作为CMPA，与硫酸铜络合，测定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的浓度。
(2)环糊精添加剂
环糊精在水中有-定的溶解度，用环糊精作为手性添加剂，加入流动相中，其分离机理与环糊精手性固定相相同,但保留行为正好相反。对映异构体与环糊精形成的包合物稳定性越强，随流动相出柱越快，保留时间越短。
(3)手性离于对添加剂
解离的有机化合物能与含互补电荷的试剂相互作用，生成电中性离子对。分离带电荷的对映异构体时，可以在流动相中添加手性的离子对试剂，对映异构体和离子对试剂形成电中性的离子对,离子对在固定相和流动相间分配系数不同而得到分离。常用的手性离子对试剂有(+)10-樟脑磺酸、奎宁等。